WB實(shí)驗(yàn)（蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)），是一項(xiàng)通過(guò)凝膠電泳按照分子量大小分離蛋白，然后再利用特異性抗體識(shí)別這些蛋白的技術(shù)，它是對(duì)蛋白進(jìn)行定性和相對(duì)定量的重要檢測(cè)方法。
盡管絕大多數(shù)研究僧在接觸該實(shí)驗(yàn)時(shí)都會(huì)被虐的體無(wú)完膚，卻也在和WB斗志斗勇的過(guò)程中積累了不少經(jīng)驗(yàn)。正所謂前人種樹(shù)，后人乘涼，現(xiàn)在中索萊寶就把前輩做WB實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)起來(lái)，希望對(duì)大家能有所幫助。
一、關(guān)于蛋白提?。?/span>
1、裂解buffer：每種裂解buffer都有其擅長(zhǎng)的用途，除了這些裂解buffer以外，為了防止蛋白降解、去磷酸化，各種蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑都是必須的；在提取蛋白的時(shí)候僅僅靠裂解液有時(shí)候也不能達(dá)到完全抽提的效果，有條件的話，可以對(duì)抽提懸液進(jìn)行10-20s的超聲破碎處理。
此外如果沒(méi)有裂解buffer，可以用1×SDSloadingbuffer代替來(lái)抽提蛋白，其效果類似于SDS裂解液，不過(guò)抽提后的樣本不能進(jìn)行濃度測(cè)定。
2、干擾蛋白：培養(yǎng)細(xì)胞、動(dòng)物組織都存在血清成分，血清中存在大量的白蛋白與免疫球蛋白，這些蛋白會(huì)經(jīng)常性的出現(xiàn)雜帶干擾，一般白蛋白雜帶在70kDa處，免疫球蛋白雜帶出現(xiàn)在50kDa處。
建議廣大戰(zhàn)友在提取細(xì)胞蛋白的時(shí)候，一定要使用PBS漂洗細(xì)胞至少3次，去除殘留的培養(yǎng)基成分；提取組織的時(shí)候，盡量去除組織中血液的殘留，這樣樣本中的干擾因素才會(huì)減少到zui低。
二、關(guān)于膠濃度及電泳條件的選擇
正確選擇凝膠濃度與電泳條件能夠讓目的蛋白區(qū)域分離開(kāi)，從而使條帶的位置，雜帶位置等一些因素的影響降到zui低。
三、關(guān)于轉(zhuǎn)膜的條件與注意事項(xiàng)
1、轉(zhuǎn)膜條件：
對(duì)于分子量10-15kDa的指標(biāo)轉(zhuǎn)膜時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，100V、冰浴45min足矣；對(duì)于分子量指標(biāo)150kDa以上的指標(biāo)，100V、冰浴2h也足夠了；其他介于15-150kDa之間的指標(biāo)100V、冰浴1h完全可以保證效果。
2、轉(zhuǎn)膜操作：
準(zhǔn)備PVDF膜的大小要與切割后的凝膠大小一致或略小，濾紙和海綿大小也要一致；制作“三明治”不能太厚也不能太薄，太厚容易使膠變形，條帶彎曲，太薄氣泡容易進(jìn)入，導(dǎo)致條帶不完整，這些都可以用增加減少濾紙量來(lái)改善。
一定要把目的蛋白分子量區(qū)域貼在膜的中間部位；分清楚正極與負(fù)極，避免反方向轉(zhuǎn)?。晦D(zhuǎn)印緩沖液要提前預(yù)冷，整個(gè)轉(zhuǎn)印過(guò)程也需要在冰浴中進(jìn)行。
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